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Criopreservación de ovocitos y embriones

Vitrificación simple de ovocitos de ratón

  Freezing Medium and Culture Medium for Mouse Reproductive Engineering

   FERTIUP & CARDMEDIUM

      España versión tabla de contenidos

Materiales y equipo

  • Ratones hembras superovuladas con PMSG y hCG
  • Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)
  • Aceite mineral
  • Micropipeta
  • Puntas de pipeta
  • mHTF (Cat. #CSR-R-B070) 
    *It can be used as the same as mHTF (CaCl2 modified HTF)
  • Hialuronidasa 1% en mHTF
  • Suero fetal bovino (FBS Cat. No. 26140-087; Gibco)
  • Filtro (Millex-GV 0.22 µm Cat. No. SLGV013SL; MILLIPORE)
  • Capilares de vidrio para la manipulación de embriones
  • Incubador humidificado (37°C, 5% CO2, en aire)
  • Materiales y equipo usado para la vitrificación y descongelamiento de los embriones (Para el lavado de ovocitos descongelados se utilizan gotas de mHTF)

Procedimientos

Preparación de las placas

  • Coloque un agota de 200µL de mHTF en una placa. Cúbrala con aceite mineral y colóquela en el incubador (37°C, 5% CO2 en aire) al menos durante 30 minutos.
  • Ponga 4 gotas (80µL/gota) de mHTF en una placa. Cúbralo con aceite mineral y coloque la placa en el incubador (37°C, 5% CO2 en aire) al menos durante 30 minutos.
  • Prepare mHTF con 20% de SFB, esterilícelo por filtración. Ponga 2 gotas (100µL/drop) del medio en una placa. Cúbralo con aceite mineral y colóquelo en un incubador (37°C, 5% CO2 in air) al menos durante 30 minutos.

Preparación de los ovocitos denudados

  • Obtenga de un ratón hembra superovulada los complejos ovocitos-cúmulos (COCs) y colóquelos en una gota de 200 µL de mHTF (Placa de ovocitos).
  • Nota: Asegúrese de llevar a cabo todas las operaciones, desde el sacrificio de la hembra para obtener sus oviductos hasta introducir los COCs en la gota de mHTF (placa de ovocitos) en el menor tiempo posible (dentro de 30 segundos).
    Más aun, cuando trabaje solo, no sacrifique muchos ratones a la vez; es preferible sacrificar uno y rápidamente obtener los oviductos antes de continuar con el ratón siguiente.

  • Añada a la gota de mHTF que contiene los COCs 20 µL de hialuronidasa al 1% y mantenga la placa en el incubador (37°C, 5% CO2 en aire) por 1 minuto.
  • Rápidamente recolecte y transfiera los ovocitos a un gota de 80 µL de mHTF ( Placa de lavado), lávelos pasándolos por las gotas en la placa de lavado.
  • Comentario : Si algunas células del cúmulos siguen adheridas a la zona pelúcida de los ovocitos, pueden ser eliminados con la manipulación con el capilar de vidrio.

Cultivo de ovocitos en una gota con SFB

Transfiera los ovocitos a la primer gota de la placa SFB para enjuagarlos. Después, transfiéralos a la segunda gota para incubarlos (37°C, 5% CO2 en aire) por 10 minutos.

Comentario: El SFB ayuda a prevenir el endurecimiento de la zona pelúcida del ovocito durante la vitrificación y descongelación.

Vitrificación simple de ovocitos de ratón

Los ovocitos puedes ser vitrificados usando el método de vitrificación para embriones. Se han de remover las células del cúmulo y cultivarlos en una gota que contenga SFB. Más aun, el método de descongelamiento es el mismo que para los embriones.
Comentario: mHTF drops are used for washing warmed oocytes.
(Please refer to the chapter of Vitrificación simple de embriones de ratón)

Fertilización in vitro usando ovocitos vitrifi cados-descongelados.

Los ovocitos vitrificados y descongelados pueden usarse para fertilización in vitro usando esperma fresco, transportados en frio o congelado y descongelado.

Nota: Hay tres métodos diferentes de preparar el MEDIO CARD®, dependiendo en si la fertilización in vitro será llevada a cabo usando esperma fresco, congelado y descongelado o transportado en frio.
Por favor, consulte el manual de instrucciones del MEDIO CARD®.

Referencias
  • Nakagata N, Takeo T, Fukumoto K, Kondo T, Haruguchi Y, Takeshita Y, Nakamuta Y, Matsunaga H, Tsuchiyama S, Ishizuka Y, Araki K. 2013. Applications of cryopreserved unfertilized mouse oocytes for in vitro fertilization. Cryobiology. Oct;67(2):188-92.

To be used for research only. DO NOT use for human gene therapy or clinical diagnosis.