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Otras técnicas

Transferencia embrionaria en oviducto

 Freezing Medium and Culture Medium for Mouse Reproductive Engineering

  FERTIUP & CARDMEDIUM

   Reproductive Engineering Manuals

En nuestro laboratorio transferimos los embriones de 2-celulas a través de la pared del oviducto de las receptoras pseudo-preñadas. Este procedimiento es más fácil y simple de realizar que el procedimiento de trasferencia embrionaria convencional, y es por lo tanto conveniente para técnicos sin experiencia.

Materiales y equipo

  • Ratón hembra en día 1 de pseudo-preñez (el día en que se observa el tapón vaginal)
  • Anestésico
  • Tijeras de micro-disección con muelle (hoja de 5 mm)
  • Pinzas de relojero #5
  • Pinza Bulldog (serrafine)
  • Grapa de sutura (Autoclip 9mm; Clay Adams Cat. No. 427631) y aplicador de grapas (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams Cat. No. 427630)
  • Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)
  • Capilares de vidrio para manipulación y transferencia embrionaria
  • Placa térmica (37°C)

Procedimientos

Preparación del ratón

  • Anestesie un ratón hembra.
  • Extraiga el ovario, oviducto y parte del cuerno uterino.
  • Coloque la pinza bulldog en el cumulo graso adosado a la bursa ovárica.

Colocando el oviducto

Como se indica en el diagrama siguiente, la trasferencia embrionaria en oviducto se lleva a cabo cortando el oviducto, insertando el capilar dentro y liberando los embriones en dirección a la ámpula.

Desafortunadamente los oviductos del ratón son pequeños y los conductos están plegados de una manera complicada, como se muestra en el diagrama del oviducto exteriorizado esquematizado abajo (A).
Esto hace muy difícil introducir el capilar en el oviducto en dirección a la ámpula por que la inserción se hace por arriba.

Para hacer este procedimiento más simple, posicione el oviducto cambiando la posición de la pinza serrafina y del ratón antes de comenzar la operación (B).

  • Observe el oviducto bajo una lupa estereoscópica y confirme la posición del infundíbulo y la ámpula usando la punta de unas pinzas, o cambiando la posición de la pinza serrafina.
  • Posicione el oviducto cambiando la posición de la pinza serrafina y del ratón.

Nota: Como los pliegues del oviducto varían entre ratón y ratón, mire detenidamente y ajuste la posición del oviducto para hacer el trabajo más fácil.
Comentario: Si usted es zurdo, posicione el oviducto de manera que le sea más fácil realizar el procedimiento con su mano izquierda.

Preparación de los embriones y de los capilares de vidrio

  • Prepare una placa con una gota de 200 µL de KSOM/AA (sin aceite mineral) y ponga 20 embriones en la gota.
  • Para preparar el capilar de vidrio para una transferencia embrionaria aspire aire y medio en intervalos alternados de 2-3 mm cada uno. Coloque diez embriones en el capilar.

Comentario: Cuando el capilar de vidrio es introducido en la gota, algo de la aceite mineral quedara en la superficie de la gota tal como se muestra debajo. Los embriones deberán juntarse con la pipeta en el lado opuesto a la mancha en la gota para así evitar aspirar la aceite mineral.
Hay evidencias que sugieren que la aceite mineral que pase al oviducto puede provocar efectos adversos en el desarrollo de los embriones a llegar a término.

Transferencia embrionaria

  • 1. Con un par de pinzas de relojero #5 y tijeras de micro-diseccion con muelle diseque la pared del oviducto entre el infundíbulo y la ámpula.
  • 2. Inserte por el corte la punta del capilar que contiene los embriones, luego empuje el capilar dentro del corte hacia la ámpula.
  • 3. Use las pinzas para sostener la parte del oviducto donde se ha insertado el capilar.
  • 4. Libere los embriones y 2-3 gotas de aire dentro de la ámpula.
  • Comentario: Si se ha realizado correctamente, usted podrá observar las burbujas de aire a través de la pared de la ámpula.

    Nota: Si usted no puede soltar los embriones y las burbujas de aire en el oviducto, retire un poco el capilar y trate nuevamente.

  • 5. Con cuidado retire el capilar del corte.
  • Nota: Transfiera los embriones luego de ajustar la posición y dirección del oviducto. Si el oviducto está alineado en paralelo al capilar, entonces será más fácil insertarlo dentro del oviducto.

  • 6. Empuje el ovario, oviducto y el cuerno uterino hacia dentro del abdomen y cierre la herida usando grapas de sutura.
  • 7. Repita el proceso para transferir los 10 embriones restantes en el otro oviducto tal como fue descrito anteriormente.
  • 8. Mantenga el ratón sobre una placa térmica a 37°C hasta que se recupere de los efectos de la anestesia.
Referencias
  • Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp.Anim. 41: 387-388.
  • Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press . ISBN 0-87969-591-9.

To be used for research only. DO NOT use for human gene therapy or clinical diagnosis.